培養細胞へのトランスフェクション・プロトコールとして、FuGENE６を用いたプロトコールを以前に紹介しましたが、今回のエントリーでは、もうひとつの代表的なトランスフェクション試薬であるLipofectamine 2000を用いたプロトコールを紹介します。
なお、基本的な操作については説明を簡略化していますので、わかりにくい部分がありましたら、以前のエントリーを参考にしてください。

Lipofectamine 2000によるトランスフェクションのプロトコール（接着細胞用）

用意するもの

Opti-MEM I 培地（血清や抗生物質を入れていないもの）
Lipofectamine 2000
プラスミドベクター

トランスフェクションの手順

1. Opti-MEM Iを2本のマイクロチューブに使用する量だけ入れる。
→プラスミドベクター 1ugに対して、62.5 uLのOpti-MEM Iを使用

プラスミドベクターとOpti-MEM Iの使用量目安
・6ウェル・プレート(1ウェルあたり)
プラスミドベクター 4 ug : Opti-MEM I 250 uL
・60 mm ディッシュ
プラスミドベクター 8 ug :Opti-MEM I 500 uL

＊その他サイズのディッシュについては、製品マニュアルの4ページを参照してください。

2. Opti-MEM Iを入れた2本のマイクロチューブのうち、片方にプラスミドベクターを加え、タッピングで軽く混ぜる。

（もう一本のOpti-MEM Iの入っているチューブは、後でLipofectamine 2000を希釈するために使う）

3. Lipofectamine 2000をタッピングにより混ぜる。
その後、Lipofectamine 2000をOpti-MEMIの入っているマイクロチューブ（プラスミドを加えていない方のチューブ）に必要量*を加えてから軽くVortex→スピンダウンする。

*基本的には、プラスミドベクター(ug) : Lipofectamine 2000(uL) = 1 : 2~3の比率で使用。
例：60 mm ディッシュで、ベクターDNAを8ug使用するときは、16~24uLのLipofectamine 2000が必要。

4. 室温で5分静置。（25分以上置かないこと）

5. プラスミドベクターを加えたOpti-MEM IをLipofectamine 2000の入ったOpti-MEM Iに加え、ゆっくりピペッティングして混ぜる。

6. 室温で20分静置。（このLipofectoamine 2000とベクターDNAの混合物は室温で6 時間まで安定とされている）


7. 細胞にLipofectamine 2000とプラスミドベクターの混合物を加え、ディッシュをゆすって拡散させる。

8. 4~6 時間後に培地を交換する（これはオプションとされているが、Lipofectamine 2000は細胞毒性が強めなので、基本的には培地交換したほうが良い）。