通常、PCR産物をサブクローニングする場合には、以前のエントリーで述べたように、プライマーの末端に予め制限酵素部位を付加しておき、PCR産物を制限酵素で消化してからライゲーションする方法がよく使われます。
しかしながら、制限酵素部位を利用したライゲーションが困難な場合もあり、その際には、PCR産物をそのままブラント・ライゲーションすることがあります。
（注：PCR産物をブラント・ライゲーションするには、3'末端に余分な塩基を付加しないタイプの耐熱性DNAポリメラーゼを使用する必要があります）

この場合、プライマーの5'末端にはリン酸基が無いため、予めリン酸化しておく必要があります。リン酸化したプライマーを入手するには、プライマーを注文する際にオプションでリン酸化してもらうか、プライマーを購入後、T４ポリヌクレオチドキナーゼ(以下、T４PNK)等を用いて、自分でリン酸化することになります。
前者はオリゴハウスがやってくれるので簡単ですが、コストがかなり高くついてしまいます。そこでここでは、後者のプロトコールについて説明したいと思います。

注）PCR産物をリン酸化してライゲーションすることも理論的には可能ですが、二本鎖よりも一本鎖の方がリン酸化の効率が高いため、通常はプライマーをリン酸化します。


プライマーのリン酸化プロトコール
今回のプロトコールでは、タカラバイオのT4 Polynucleotide Kinase (cat. no. 2021)を使用。

＜量論について＞
ここでは、25倍希釈したときに濃度が0.5 uMとなるようなリン酸化プライマーのストック溶液（つまり12.5 uM)を10uL調整することを目標とする。

準備
予めプライマーを10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA pH 8.0などに溶かし、50 uMの溶液にしておく。（EDTAは1mMでなく0.1mMで十分）

12.5 uM(25倍希釈で0.5uMになる) のリン酸化プライマー溶液を10 uL調整しようとすると、12.5 uM×10 uL = 125 pmolのプライマーが必要となる。
したがって、50 uMに調整したプライマー溶液を2.5 uL使用する。

反応系のスケール：20 uL
プライマー（50uM） 2.5 uL
10 × T4 PNK Buffer 2 uL
T4 PNK (10 U / uL) 1 uL
10 mM ATP 2 uL　(最終濃度1 mM)
滅菌Milli Q水　　　 〜 20 uL

注）プライマーはフォワードとリバースを一緒にリン酸化することも可能だが、別々にリン酸化した方がいろいろと融通が効くのでお勧め。
また、反応系のスケールは適宜変更可能。

上記を調整したら、37 ℃で30分間インキュベートし、さらに続けて70 ℃で5分間インキュベートする。（インキュベーターやサーマルサイクラーを使用）
↓
30 uLのMilliQを加えて50 uLとした後、エタノール沈殿を行う。
（5 uLの 3 M 酢酸ナトリウムを加え、さらに125 uLの100 %エタノールを加える。ボルテックス後、氷上で15分静置）
↓
15,000 rpm、4 ℃で15分間遠心する。
↓
上清をピペットマンで取り除き、70% エタノールを180 uL加え、15,000 rpm、4 ℃で5分間遠心する。
↓
上清を取り除き、遠心エバポレーター等で乾燥させる。
↓
10 uLの滅菌MilliQ水 に溶解したら-20℃で保存する。なお、滅菌MilliQ水の代わりにTEを使用しても良い。

＊実際には、収率は100%ではないため、収量は想定以下になりますが、それでもPCRに使うには十分な量が得られます。

Appendix
10 mM ATPの調整法

用意するもの
1 M Tris-HCl pH 8.0(滅菌済)
ATP（粉末）・・・ナトリウム塩でもよい　(SIGMA A7699等)
滅菌MlliQ水

まず、100 mLのビーカーに1 M Tris-HCl (pH 8.0)を2.5 mL入れ、滅菌MilliQ水を90 mLくらいまで注ぐ。（Tris-HClの最終濃度は25 mM）

次に、ATPの分子量（ATP 二ナトリウム塩ならば 551.14)×0.001グラムのATPをビーカーに加えて、スターラーで溶かす。
最後にメスシリンダーに移して、滅菌MilliQ水で100 mLにメスアップする。
0.22 umのフィルターで濾過滅菌した後、マイクロチューブや遠心チューブなどに分注して-20 ℃で保存。