さて、今回のエントリーからは数回に渡って、PCRのプロトコールについて書いていきたいと思います。PCRの原理や応用に関しては、すでに多くの教科書や実験書で説明されていますから、ある程度のことはほとんどの方がご存知でしょう。ですから、ここではそれらにはあまり触れず、実際にPCRを行う際に必要となる反応系の構築について説明していきます。


PCRの反応系の調整

ここでは、PCR実験を行うにあたり、手早くPCRの反応系を構築するための基本的な考え方について説明していきます。


PCRの反応系は、基本的に次の試薬を用いて調整します。

・ 耐熱性DNAポリメラーゼ
・ プライマー
・ dNTPミックス (dATP, dTTP, dGTP, dCTPを含む)
・ テンプレート(鋳型) DNA
・ 10 x PCRバッファー
・ マグネシウム塩溶液 (塩化マグネシウムや硫酸マグネシウムの水溶液)

これらの中で、プライマーとテンプレートDNA以外は、耐熱性DNAポリメラーゼのキットに添付されている場合が多いので、基本的にはそれを利用します。
また、PCRバッファーの種類によっては、マグネシウム塩を予め含んでいるものがあり、この場合は、マグネシウム塩溶液は不要となります。

PCRの反応系を調整する際には、これらの試薬をどれだけ入れるのか考えることになります。
それでは、さっそく50 uLの反応系を例にしながら見ていきましょう。


反応系の調整　（50 uLスケールを例として）

1. 耐熱性DNAポリメラーゼ

50 uLの系では、1〜1.25 U(ユニット)の耐熱性DNAポリメラーゼを使用します。
（DNAポリメラーゼの種類によっては、これと異なるユニット数が推奨されていること場合があります。　基本的には、酵素に添付されている使用説明書に従ってください）

5 U/uLのDNAポリメラーゼを使用する場合、
1U分として、1U÷5(U/uL) = 0.2 uLが必要となります。

このときの反応系におけるDNAポリメラーゼの濃度は1U/50uL=0.02U/uLであり、この濃度は反応系のスケールが変わっても一定です。したがって、反応系の大きさを変えた場合は、以下の式から、必要なDNAポリメラーゼの量を計算することができます。

添加するDNAポリメラーゼの量(uL) ＝　[0.02U/uL x 反応系のスケール(uL)]/DNAポリメラーゼの単位ユニット（U/uL）


例　20 uLの反応系で、5U/uLのDNAポリメラーゼを最終濃度0.02U/uLで使用する場合

上記の式にあてはめると、
必要なポリメラーゼの量は、[0.02x20]/5=0.08uLとなります。
実際には、このような微量は、ピペットマンで秤量できませんから、数反応分のマスターミックスをつくることになります。


2. プライマー

プライマーの濃度

プライマーは順方向用と逆方向用の2種類を使用しますが、プライマーの最終濃度はどちらも同じにし、0.1~ 1 uMとします。
まずは0.5 uMを目安とし、必要に応じて最適化すれば良いでしょう。
なお、プライマー濃度が高すぎると、非特異的な増幅が起こりやすくなります。


プライマーの調整
プライマーは乾燥状態か溶液状態で提供されます。乾燥状態の場合、まずプライマーの入ったチューブをスピンダウンしてから、TEバッファー*などを加えて、任意の濃度に調整します。なるように、プライマーを溶かします。この時の濃度は、50ないし100 uM (pmol/uL)が良いでしょう。
例えば、プライマーを最終濃度0.5 uMで使用するならば、プライマーを50uMの溶液に調整しておきます。それにより、50uLの反応系ならば、0.5uLのプライマー溶液を加えればいいわけです。
ほとんどのサプライヤーは、プライマー収量のデータを添付してくれますから、プライマーの溶解に必要なバッファー量は、簡単に求めることができます。

*この時のTEバッファーは、10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA pH 8.0がおすすめです。
EDTAの濃度を通常の1mMではなく、0.1mMにしているのは、できるだけ反応系のマグネシウムイオンをキレートしたくないためです。


TEに溶解したプライマーは、凍結再融解の繰返しやコンタミを避けるために、分注して-20℃で保存するのがベストです。
プライマーの最終濃度が低い場合などは、50 or 100 uMのままでは使いづらいかもしれません。そのような場合は、一部を使いやすい濃度へと希釈し（working solution）、残りは希釈せずにstock solutionとして保存しておくとよいでしょう。


プライマーの保存
Working solution：4℃で保存（一般的に２週間程度まで保存可能。ただし、精製グレードやメーカーによって異なってくる）
Stock solution: -20 ℃で保存 (1年以上保存可能)

＊プライマーの設計については、後の方のエントリーで説明する予定です。

以降、次回のエントリーに続きます。