2010年11月

サブクローニングの際に、コンストラクトを設計したり、cDNAにタグをつけたり、あるいは単に制限酵素地図を作成したりする際に、シンプルな配列編集・解析ソフト(シークエンスエディタ)があると非常に便利です。

商用の高機能な遺伝子解析ソフトを導入しているラボも少なくありませんが、これらのソフトは基本的にインストールできるPCの台数に制限があり、新たにインストールする場合には、その都度ライセンスを購入する必要があります。そのため、ラボ共用のPCのみにインストールされている場合が多いのではないでしょうか。しかし、共用のPCでは、使いたいときにいつでも使える訳ではありませんから、上述したような簡単な配列編集や解析作業でしたら、やはり個人のPCで行うほうが便利です。

そこで、今回のエントリーではLablogueオススメのフリーで使えるシークエンスエディタを紹介したいと思います。


BioEdit
対応OS Windows XP
http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html
管理人がWindows PCを使っていた時にはBioEditを使用していました。このBioEditは直感的に操作できので、とても使いやすく、さらに機能も充実しています。おそらく今でも多くの人が愛用しているのではないでしょうか。
Windows XPを使用している人には、自信をもっておすすめできるソフトです。


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Serial Cloner
対応OS WIndows, Mac, Linux

http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html

管理人は数年前にWinからMacへと乗り換えたのですが、MacではBioeditのようなフリーで高機能なシークエンスエディタを見つけることができず、非常に苦労していました。様々なソフトを試したてはみたものの、どれも一長一短でなかなか「これは」というようなソフトに出会えずにいたのです。
そんな中、ようやく見つけたのが、このSerial Clonerです。
使いやすく、また機能的にもフリーウェアとは思えないほど充実しています。Macで使えるシークエンスエディタとしてはイチオシです。

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スクリーンショット

なお、Serial Clonerはフリーウェアですが、PayPalを通じて寄付ができますので、気に入った方がいらっしゃいましたら、少額でも寄付していただけたら幸いです。(なお、LablogueとSerial Clonerは一切関係ありません。ただ、こうした寄付が将来的には研究者の役に立つツールの開発に繋がっていくはずなので、一種の投資だと考えていただけたらと思います)




Macで使えるその他のシークエンス関連ソフト

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4Peaks
http://mekentosj.com/science/4peaks/
シークエンスデータを閲覧するためのビューワー。シークエンスのデータをPC上で確認したい場合にオススメです。

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eBioX
http://www.ebioinformatics.org/ebiox/
MacユーザーでX11をインストールされている方にはeBioXというソフトもあります。ただ、Lablogue管理人は使用したことがないため、使用感などは不明です。参考としてリンクのみ貼っておきます。
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「分子生物学実験の基礎」と題して、サブクローニングのプロトコールを数回に渡って紹介してきましたが、今回のエントリーではひとまずその区切りとして、ライゲーションのプロトコールを紹介します。これで、サブクローニングに必要なプロトコールはほぼカバーしましたので、過去のエントリーと合わせてご活用いただければと思います。


ライゲーションのプロトコール

ここでは、Takara のDNA Ligation Kit ver. 2.1(cat. no. 6022) を使用したライゲーションのプロトコールを紹介します。






反応系の例(10 uLスケール)
プラスミドベクター 1 uL
インサートのDNA 4 uL
Solution 1 5 uL
10 uL


留意点
・ 温度が高いと(26℃以上)環状DNAが形成されにくくなる。
・ ライゲーションにおいては、ベクターが3~5 kb 程度ならば、ベクターの量は50 ng程度が目安。50 ng/uLになるように調整しておく。


ワンポイントアドバイス
反応液の体積が小さいので、1.5 mLのマイクロチューブを使用する場合は丸底のものを使う(平底だと、底面と壁面に反応液がべったりと張り付いてしまうため)。もし、平底のチューブしかなければ、1.5 mLマイクロチューブは使用せず、PCRチューブを使用すると良い。


手順

0. インキュベーターorサーマルサイクラーを16℃に設定しておく。

1. SolutionⅠ: DNA溶液(インサート及びベクター)= 1 : 1で混合(優しくピペッティング)し、16 ℃で15〜30分もしくは16 ℃でオーバーナイト (実質的な反応は5分程度で終わると言われている)。

2. ライゲーション産物全量を使用して、大腸菌をトランスフォーメーションさせる。
(トランスフォーメーションのプロトコールは、こちらから)


Appendix
・インサートDNAとベクターのモル比に関して
一般的に、ベクターとインサートDNAのモル比を1:8程度にすると、最もインサートDNAが入る頻度が高くなると言われています。Takara DNA Ligation Kit ver. 2.1の使用説明書には、ベクターとインサートDNAのモル比を1: 0.1〜10まで変えた場合のトラフォメ効率のデータが記載されているのですが、このデータを見る限りベクターの3倍以上のインサートDNAが効率的なライゲーションに必要と言えるでしょう。

・DNAのモル数を求めるには
上述したように、効率的なライゲーションを実現するには、一般的にベクター:インサートDNA= 1: 3〜8(モル比)にする必要があります。そのためには、DNAの物質量(モル数)を求める必要があるわけですが、いかんせんDNAは大きな分子であるにもかかわらず、実験で使用する量は微量のため、物質量を求める際に、計算ミスを起こしやすくなります(特に桁数)。
そこで、Lablogue管理人はそうしたミスを防ぐために、以下のようにして計算しています。例を見てください。

例 50ngのpBluescript Ⅱ(約3,000 bp)のモル数の求める場合
DNAの質量の単位をpg(ピコグラム)にしてから、分子量で割る。

dnacalc.png
*660(Da/bp):塩基対のおよその分子量 (ナトリウム塩として)

この方法では、DNAの質量をpg(ピコグラム)で表すことにより分母が見かけ上大きくなるので、計算がしやすくなり、また解の桁が小さくなりすぎないため、位を間違いにくいというメリットがあります。
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