前回のエントリーでは、プラスミドのプレパレーションを行うに当たって、知っておくべき事項を概説しました。今回のエントリーでは、その補足として、プラスミドのコピータイプ別に、プレップする際の培養スケールをどのくらいに設定したら良いのか説明したいと思います。


プラスミドのコピータイプと培養スケール
以下に、各コピータイプのプラスミドごとに一般的な培養のスケールを紹介しておきます。

・高コピープラスミドの培養スケール
例： pcDNA3やpBluescriptⅡなど

サブクローニングまたはシークエンス用のプラスミドのプレップ
→培養スケール　2mL

高コピーの場合、上記目的のためのプラスミドを用意するには2 mLの培養液で十分です。

トランスフェクション用プラスミドのプレップ
→培養スケール 100 mL以上

培養細胞へのトランスフェクション等、大量(数百ug～数mg程度)のプラスミドが必要な場合。

・低コピープラスミドの培養スケール
例：pET系のプラスミド等

サブクローニングまたはシークエンス用プラスミドのプレップ
→培養スケール　10~20 mL



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プラスミドのプレパレーション　その①

前回までのエントリーでは、短時間で済む大腸菌のトランスフォーメーションについて説明してきました。通常、トラフォメが終わったら次はプラスミドのプレパレーション（通称 プレップ）を行うことが多いため、今回のエントリーからはプラスミドのプレップについて、説明していきたいと思います。


・プレップ法の選択

大腸菌をトラフォメして培養したら、その次は大腸菌の中で増やしたプラスミドを精製することになります。この作業はプラスミドのプレパレーションと呼ばれ、さらにその後の実験に供するプラスミドや保存用のプラスミドを用意（プレパレーション）することを意図します。

プラスミドのプレップにはいくつかの方法がありますが、基本的には以下に挙げる3つの方法で多くの実験に対応できます。
これらの方法のうち、どれを用いるかは、精製したプラスミドを何に使うのかによって決まります。


1. アルカリプレップ（ポリエチレングリコール沈殿、通称PEG沈：無し）
→　制限酵素処理や電気泳動による確認など、プラスミドの精製グレードが比較的低くてもよい場合に用います。

2. アルカリプレップ（PEG沈：有り）
→　シークエンシングのテンプレート用として使用するプラスミドを精製するのに用います。

3. 陰イオン交換クロマトグラフィーカラムによる精製　（市販されているカラム式の精製キットを使用）
→　培養細胞へのトランスフェクションに使用するプラスミドなどの、高い精製グレード（大腸菌由来のエンドトキシンを含まない）が必要な場合や、大量のプラスミドを精製したい場合に用います。


・培養スケールの検討
プレップを始める際には、まず実験に必要なプラスミドの量に応じて、トラフォメした大腸菌をどのくらいのスケールで培養するのか決める必要があります。
培養スケールを決定する上で、注目しなければならないのは、プラスミドがもつ複製起点の種類です。
複製起点の種類によって、ひとつの大腸菌細胞内で存在できるプラスミド分子の数がおおよそ決まっており、数が多いものをhigh-copy（高コピーor多コピー）、少ないものをlow-copy（低コピー）のプラスミドと言います。
high-copyの場合はlow-copyに比べて、より小さな培養スケールで必要量を確保できます。

サブクローニング用やトランスフェクション用のプラスミドなどは、pMB1ori やColE1 oriといった複製起点を改変して高コピー化した複製起点を持つことが多く、その一方、タンパク発現用のプラスミドなどは低コピーの複製起点をもつのが一般的です。自分の使うプラスミドがどちらのタイプに属するかどうかは、プラスミドを購入した際に添付されている資料やインターネットで調べることができます。（以下に例を挙げておきます）


http://www.promega.com/techserv/techref/nucleic_acids.htm#b03
http://www.qiagen.com/plasmid/bacterialcultures.aspx


次回のエントリーでは、各タイプのプラスミドについて、一般的な培養スケールの例を紹介する予定です。