一連のエントリーでレーザーマイクロダイセクションを用いた微小組織切片における発現解析について、プロトコールを紹介してきましたが、今回の逆転写とPCRで最後となります。
過去のプロトコールはこちらからご覧ください。

レーザーマイクロダイセクションにより切り出した組織切片由来RNAの逆転写とPCR

ここでは、TakaraのPrimSscript 1st strand synthesis kit (TaKaRa Bio)使用

以下をon iceで調合する
Random hexamers (50 uM) 0.4 uL
Template 8.2 uL
dNTP mix (10 mM each) 1 uL
RNase-free water　 0.4 uL

上記を0.2 mL PCRチューブ内で混ぜ、65℃で5 minインキュベートし、 on ice

その後、以下のものを加えて混合したら、RT反応を行う。

5 x Buffer　4 uL
RNase inhibitor 0.5 uL
PrimeScript RTase 1 uL
RNase-free water　〜 20 uL　(4.5 uL)


42 ℃ 45 min
↓
70 ℃ 15 min ・・・ RTaseを失活させる


RT反応の間にPCRの準備をする。

必ず、そのままPCRへ移行する。（凍結保存は厳禁）
微量cDNAはfreeze-thawで分解してしまう。（実際にバンドが薄くなってくる）。



PCR反応

用意するもの
Takara ExTaq
プライマー

反応系 25 uLスケール
MilliQ 18.875 uL
10 x Ex taq Buffer　 2.5 uL
dNTP mix (2.5 mM each) 2 uL (final conc. 0.2 mM)
Primer F R mix (5 uM each) 1 uL (final conc. 0.2 uM)
Ex taq 0.125 uL
Template (2x diluted) 0.5 uL

PCRの例
94 ℃ 1 min
94 ℃ 30 sec
60 ℃ 30 sec 　 4 5 cycles
72 ℃ 60 sec
4 ℃ ∞


逆転写時のプライマーに関して
プライマーにはoligo-dTとrandom hexamerがあるが、長いmRNAに関してはrandom hexamerでなければ、後のPCRで増幅されないことがある。どちらのプライマーを用いるかは、最適化が必要であるが、経験上、random hexamerの方が、バイアスがかからないことが多い。