今回のエントリーは大腸菌を用いたタンパク質の発現②ということで、で解説したBL21株の形質転換に続き、グリセロールストックの作製について説明します。

<形質転換した大腸菌のグリセロールストック作製法>
タンパク質発現用に形質転換した大腸菌を保存する際には、マスタープレートの作製よりも、グリセロールストックを作ることを推奨します。これは、グリセロールストックの方が長期保存に適し、長期に渡って同じ菌株を使用できるというメリットがあるためです。
通常、形質転換した大腸菌のグリセロールストックを作る際はグリセロールの最終濃度が15%とされていることが多いのですが、pETベクターはグリセロール濃度が10 %を超えると不安定化するとされており、7-8 %程度にします。
なお、個人的な経験ではpET以外のプラスミドでも、グリセロール濃度8%で長期保存は可能でした。


1. 単一のコロニーを滅菌済みのチップor爪楊枝でピックアップし、クロラムフェニコールとpETベクター選択用の抗生物質を含むLB培地に植菌する(LB培地の量は必要なグリセロールストックの量に応じて決める。通常は5 mL程度でよい) 。

2. 37 ℃で振とう培養する。 途中で吸光度を測りながらO.D. 600が0.6~0.8に達するまで培養する。

3. 大腸菌を培養している間に、1.5mLマイクロチューブに80 uLの80 % グリセロール(グリセロール : MilliQ= 8 : 2(体積比)で混合し、オートクレーブ滅菌したもの)を分注しておく。80%グリセロールは粘度が高いので、先端をカットして、穴の径を大きくしたチップを使用すること。

4. O.D.600が0.6~0.8まで達したら、80 % グリセロールが入っているマイクロチューブにその培養液を720 uL加え、かるくボルッテクスにかける。その後、液体窒素で凍結し、-80 ℃で保存。
また、培養液を2 mL程度残しておき、それをミニプレップ→電気泳動して、発現ベクターを保持しているか確認する。
このようなグリセロールストックを5個程度のコロニーから作っておく。また、cDNAが挿入されていない空の発現ベクターによって形質転換した大腸菌からもストックを作っておく。(ネガティブコントロール用として)


これで、ようやくタンパク発現用のベクターを持った大腸菌の準備ができました。続いて、この大腸菌を使い、小スケールによるタンパク発現の条件検討を行いますが、それについては、また後日に説明します。


大腸菌を用いたタンパク質の発現①